Objavenie medzinárodnej skupiny vedcov, ktorá zahŕňa dvoch Brazílčanov, môže prispieť k minimalizácii znečistenia spôsobeného týmto materiálom
Medzinárodnej skupine vedcov, ktorej sa zúčastňujú dvaja Brazílčania z University of Campinas (Unicamp), sa podarilo zlepšiť výkonnosť PETázy, enzýmu schopného živiť sa polyetyléntereftalátom, PET plastom. Po objavení PETázy v novom druhu baktérií v roku 2016 sa skupina vedcov snažila získať štruktúru enzýmu a porozumieť jeho fungovaniu. Pri tomto procese náhodne skončili vytváraním mutácie enzýmu, ktorá má ešte väčšiu afinitu k PET - teda väčší potenciál degradovať plast.
Táto práca má obrovský potenciál pre praktické využitie, pretože sa odhaduje, že v oceánoch sa ročne vypustí medzi 4,8 až 12,7 milióna ton plastu - čo je počet, ktorý má tendenciu iba pribúdať. Plasty, ktoré sa hromadia aj na najodľahlejších plážach planéty, sa používajú tak práve kvôli ich odolnosti proti degradácii, ktorá najviac ohrozuje životné prostredie. Keď sa zlikviduje, napríklad PET fľaša, môže zostať v prostredí 800 rokov - navyše s rastúcim a alarmujúcim problémom mikroplastov.
- Pochopiť environmentálny dopad plastového odpadu na potravinový reťazec
- Aký je pôvod plastu, ktorý znečisťuje oceány?
Pri tom všetkom je ľahké pochopiť veľký záujem, ktorý vzbudil objav enzýmu schopného stráviť polyetyléntereftalát. Tento enzým nazývaný PETáza teraz zvýšil svoju schopnosť odbúravať plasty. Novinka bola opísaná v článku publikovanom v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS).
Na výskume sa zúčastnili dvaja vedci z Chemického ústavu Štátnej univerzity v Campinas (IQ-Unicamp) v spolupráci s výskumníkmi zo Spojeného kráľovstva (University of Portsmouth) a USA (National Renewable Energy Laboratory). Sú nimi postdoktorandský kolega Rodrigo Leandro Silveira a jeho vedúci, profesor a prorektor pre výskum v Unicamp Munir Salomão Skaf.
„Polyetyléntereftalát, ktorý sa používa hlavne pri výrobe nápojových fliaš, sa tiež široko používa pri výrobe odevov, kobercov a iných predmetov. V našom výskume sme charakterizovali trojrozmernú štruktúru enzýmu schopného stráviť tento plast, vytvorili sme ho, zvýšili jeho degradačnú schopnosť a preukázali sme, že je aktívny aj v polyetylén-2,5-furándikarboxyláte (PEF), ktorý je náhradou za PET vyrobený z z obnoviteľných surovín, “povedala Silveira pre agentúru Agência FAPESP.
Záujem o PETázu vznikol v roku 2016, keď skupina japonských vedcov vedená Shosuke Yoshidou identifikovala nový druh baktérií Ideonella sakaiensis , ktorý je schopný využívať polyetyléntereftalát ako zdroj uhlíka a energie - inými slovami schopný živiť sa PET. Je to dodnes jediný známy organizmus s touto kapacitou. Doslova rastie na PET.
„Okrem identifikácie Ideonella sakaiensis Japonci zistili, že produkuje dva enzýmy, ktoré sa vylučujú do životného prostredia. Jedným zo vylučovaných enzýmov bola PETáza. Vďaka svojmu stupňu kryštalinity je PET polymér, ktorý je veľmi ťažké degradovať. Odborne používame výraz „odpor“ na pomenovanie vlastnosti, ktorú musia niektoré vysoko balené polyméry odolávať degradácii. PET je jedným z nich. Ale PETáza napáda a štiepi ju na malé jednotky - mono (2-hydroxyetyl) tereftalová kyselina (MHET). Jednotky MHET sa potom prevedú na kyselinu tereftalovú [druhým enzýmom] a absorbujú a metabolizujú ich baktérie, “uviedla Silveira.
Všetky známe živé bytosti používajú na prežitie biomolekuly. Všetci okrem Ideonella sakaiensis, ktorá dokáže používať syntetickú molekulu vyrobenú ľuďmi. To znamená, že táto baktéria je výsledkom veľmi nedávneho evolučného procesu, ku ktorému došlo v posledných niekoľkých desaťročiach. Dokázal sa adaptovať na polymér, ktorý bol vyvinutý na začiatku 40. rokov a v priemyselnom meradle sa začal používať až v 70. rokoch. Kľúčovou súčasťou je preto PETáza.
„PETáza robí najťažšiu časť, ktorou je rozbitie kryštalickej štruktúry a depolymerizácia PET v MHET. Práca druhého enzýmu, ktorý transformuje MHET na kyselinu tereftalovú, je už oveľa jednoduchšia, pretože jeho substrát je tvorený monomérmi, ku ktorým má ľahký prístup, pretože sú dispergované v reakčnom prostredí. Štúdie sa preto zameriavali na PETázu, “vysvetlila Silveira.
Ďalším krokom bolo podrobné preštudovanie PETázy a to bol príspevok nového výskumu. "Naším zameraním bolo zistiť, čo dalo PETase schopnosť robiť niečo, čo iné enzýmy nedokázali veľmi efektívne." Prvým krokom bolo získanie trojrozmernej štruktúry tohto proteínu, “uviedol.
„Získanie trojrozmernej štruktúry znamená objavenie súradníc x, yaz z každého z tisícov atómov, ktoré tvoria makromolekulu. Naši britskí kolegovia túto prácu vykonali pomocou dobre známej a použitej techniky zvanej röntgenová difrakcia, “vysvetlil.
Modifikovaný enzým sa lepšie viaže na polymér
Po získaní trojrozmernej štruktúry začali vedci porovnávať PETázu s príbuznými proteínmi. Najpodobnejšia je kutináza baktérie Thermobifida fusca, ktorá degraduje kutín, akýsi prírodný lak, ktorý pokrýva listy rastlín. Niektoré patogénne mikroorganizmy používajú kutinázy na prelomenie kutínovej bariéry a na prispôsobenie výživných látok nachádzajúcich sa v listoch.
Obrázok: Štruktúra PETázy, modrá, s reťazcom PET (v žltej farbe) spojeným s aktívnym miestom, kde bude degradovaná. Tlačová správa / Rodrigo Leandro Silveira.
"Zistili sme, že v oblasti enzýmu, kde dochádza k chemickým reakciám, takzvaného" aktívneho miesta ", vykazovala PETáza určité rozdiely vo vzťahu k kutináze. Má otvorenejšiu aktívnu stránku. Prostredníctvom počítačových simulácií - a práve do tejto časti som prispel najviac - sme mohli študovať molekulárne pohyby enzýmu. Zatiaľ čo kryštalografická štruktúra získaná röntgenovou difrakciou poskytuje statické informácie, simulácie umožňujú získať dynamické informácie a objaviť špecifickú úlohu každej aminokyseliny v procese degradácie PET, “vysvetlil výskumník z IQ-Unicamp.
Fyzika pohybov molekúl je výsledkom elektrostatických atrakcií a odpudzovania obrovskej sady atómov a teploty. Počítačové simulácie nám umožnili lepšie pochopiť, ako sa PETáza viaže a interaguje s PET.
"Zistili sme, že PETáza a kutináza majú v aktívnom mieste dve rôzne aminokyseliny." Pomocou postupov molekulárnej biológie sme potom vytvorili mutácie v PETáze s cieľom transformovať ju na kutinázu, “uviedla Silveira.
"Keby sme to dokázali, ukázali by sme, prečo je PETáza PETáza, to znamená, že by sme vedeli, aké sú zložky, ktoré jej dávajú zvláštnu vlastnosť degradovať PET." Ale na naše prekvapenie, keď sa snažíme potlačiť zvláštnu aktivitu PETázy, to znamená, že keď sa pokúšame transformovať PETázu na kutinázu, vyrábame ešte aktívnejšiu PETázu. Snažili sme sa znížiť aktivitu a namiesto toho sme ju zvýšili, “uviedol.
To si vyžadovalo ďalšie výpočtové štúdie, aby sa pochopilo, prečo bola mutantná PETáza lepšia ako pôvodná PETáza. Pomocou modelovania a simulácií si bolo možné všimnúť, že zmeny produkované v PETáze uprednostňujú spojenie enzýmu so substrátom.
Modifikovaný enzým sa lepšie viaže na polymér. Táto väzba závisí od geometrických faktorov, to znamená, že typ „kľúč a zámok“ zapadá medzi tieto dve molekuly. Ale tiež termodynamických faktorov, to znamená interakcií medzi rôznymi zložkami enzýmu a polyméru. Elegantným spôsobom, ako to opísať, je povedať, že modifikovaná PETáza má „väčšiu afinitu“ k substrátu.
Z hľadiska budúcej praktickej aplikácie, získania prísady schopnej odbúravať tony plastového odpadu, bola štúdia obrovským úspechom. Otázka, čo robí z PETázy PETázu, však zostáva nezodpovedaná.
„Kutináza má aminokyseliny a a b. PETáza má aminokyseliny x a y. Predstavili sme si, že výmenou x a y za a a b môžeme transformovať PETázu na kutinázu. Namiesto toho vyrábame vylepšenú PETázu. Inými slovami, tieto dve aminokyseliny nie sú vysvetlením rozdielového správania týchto dvoch enzýmov. Je to niečo iné, “povedala Silveira.
Prebiehajúci vývoj
Kutináza je prastarý enzým, zatiaľ čo PETáza je moderný enzým, ktorý je výsledkom evolučného tlaku, ktorý umožnil Ideonella sakaiensis adaptovať sa na médium, ktoré obsahuje iba alebo hlavne polyetyléntereftalát ako zdroj uhlíka a energie.
Spomedzi mnohých baktérií, ktoré nedokázali použiť tento polymér, niektoré mutácie generovali druhy, ktorým sa to podarilo. Táto baktéria sa začala množiť a rásť oveľa viac ako ostatné, pretože mala dostatok potravy. S tým sa to vyvinulo. Prinajmenšom toto je vysvetlenie poskytnuté štandardnou evolučnou teóriou.
"Skutočnosť, že sme dostali lepšiu enzýmu vykonaním malej zmeny, výrazne naznačuje, že tento vývoj ešte nebol dokončený." Stále existujú nové evolučné možnosti, ktoré je potrebné pochopiť a preskúmať s cieľom získať ešte účinnejšie enzýmy. Vylepšená PETáza nie je koniec cesty. Je to len začiatok, ”uviedla Silveira.
Pokiaľ ide o aplikáciu, ďalším krokom je prechod z laboratórneho do priemyselného rozsahu. Z tohto dôvodu budú potrebné ďalšie štúdie týkajúce sa inžinieringu reaktorov, optimalizácie procesov a zníženia nákladov.
